Facility für Elektronenmikroskopie City-Campus
Die Elektronenmikroskopie City Campus arbeitet auf dem Gebiet der biologischen Ultrastrukturforschung in Kooperation mit Wissenschaftler*innen innerhalb des Max-Planck-Institutes für Multidisziplinäre Naturwissenschaften und dem Göttinger Wissenschaftscampus. Wiebke Möbius ist seit 2004 die Leiterin dieser Service Facilty, die von 2012 bis 2018 als Elektronenmikroskopie-Plattform auch Teil des Cluster of Excellence and DFG Research Center Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain (CNMPB) war. Zurzeit gehören die zwei technischen Angestellten Torben Ruhwedel und Boguslawa Sadowski sowie Anna Steyer zum Team.
Innerhalb der Elektronenmikroskopie City Campus wird standardmäßig Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zur Analyse der Ultrastruktur in subzellulärer Auflösung durchgeführt. Basierend auf der wissenschaftlichen Fragestellung verwenden wir für die morphologische Analyse in Plastik eingebettete Proben oder zur Lokalisation von Molekülen innerhalb des Zell- oder Gewebekontextes Immunoelektronenmikroskopie auf ultradünnen Cryoschnitten (Möbius, 2016). Zur ultrastrukturellen Untersuchung werden die Proben entweder chemisch fixiert und konventionell eingebettet oder hochdruckgefroren (HPF) und in Harz eingebettet nach einer Gefriersubstitution (FS). Während konventionelle Präparationen eher für quantitative Vergleiche von Phänotypen geeignet sind, enthüllen hochdruckgefrorene Proben oftmals detaillierte Ultrastrukturen, welche häufig in konventionellen Präparationsmethoden aufgrund der chemischen Fixierung und Einbettung verloren gehen. Dies ist besonders wichtig im Bereich der Ultrastrukturuntersuchung von Myelin (z. B. beschrieben in Möbius et al. 2016). Wir entwickeln und modifizieren kontinuierlich Protokolle für die Probepräparation wie zum Beispiel Mikrowellen-unterstützte-Probenpräparation für spezialisierte Anwendungen wie großflächige 2D Bilder oder 3D Volumina mithilfe von Fokussierten Ionenstrahl Rasterelektronenmikroskopie (FIB-SEM) (z. B. Steyer et al, 2019a und 2019b).
Zu unserer Ausstattung gehören zwei Transmissionselektronenmikroskope für Routinearbeiten: ein Zeiss EM 900 und ein LEO 912AB Omega. Seit 2011 haben wir die Möglichkeit, mit einer Leica HPM100 Hochdruckfrieren durchzuführen, um durch schnelle Cryo-Immobilisation die optimale Strukturerhaltung von Proben zu erreichen, die anfällig für Fixierungsartefakte sind. Um sehr schnelle Ereignisse sichtbar zu machen, wie zum Beispiel die Fusion von synaptischen Vesikeln mit einer zeitlichen Auflösung von wenigen Millisekunden, besitzt die Abteilung der Molekularen Neurobiologie (Nils Brose) eine Leica HPM100 mit Lichtstimulation und eine Leica HPM ICE mit der Möglichkeit der Licht- und Elektrostimulation. Diese Geräte werden von Benjamin Cooper und Cordelia Imig aus der Abteilung Molekulare Neurobiologie betrieben.
In 2012 trat die Elektronenmikroskopie City Campus dem Cluster of Excellence and DFG Research Center Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain (CNMPB) als Elektronenmikroskopie-Plattform bei. Mithlfe des CNMPBs konnte 2014 ein Zeiss Crossbeam 540 angeschafft und installiert werden. Dieses Gerät ist ein Rasterelektronenmikroskop mit einem fokussierten Ionenstrahl (FIB-SEM), wobei der Ionenstrahl in-situ zum Abtragen von Material verwendet werden kann. Mit dieser Methode kann ein definiertes Volumen einer Probe für das sequentielle Aufnehmen von Bildern und anschließende 3D-Rekonstruktion zugänglich gemacht werden. Die Oberfläche, die zu einem Zeitpunkt abgetragen werden kann, ist limitiert, allerdings können mehrere Bereiche nacheinander auf der gleichen Probe bearbeitet werden. Als untere Grenze besteht die Möglichkeit hauchdünne Schnitte von 5 nm zu schneiden, womit die Z-Auflösung erhöht wird und Datenvolumina von fast isotroper Auflösung erstellt werden können.
Das Schneiden mit dem Ionenstrahl kann als Mikrometer-Werkzeug verwendet werden, um TEM-Lamellen aus fast jedem Material herzustellen. Vitrifizierte gefrorene TEM Lamellen können auf diese Weise für Cryo-TEM Tomographie von biologischen Proben unter Cryo-Bedingungen (-150°C) hergestellt werden.
Referenzen:
Möbius W (2016) Immunoelectron Microscopy: High-Resolution Immunocytochemistry. In: Ralph A Bradshaw and Philip D Stahl (Editors-in-Chief), Encyclopedia of Cell Biology, Vol 2, Waltham, MA: Academic Press, 2016, pp. 32-43
Möbius W, Nave KA, Werner HB (2016) Electron microscopy of myelin: Structure
preservation by high-pressure freezing. Brain Res. 2016 Jun 15;1641(Pt A):92-100.
doi: 10.1016/j.brainres.2016.02.027. Review. PubMed PMID: 26920467
Steyer AM, Ruhwedel T, Möbius W. Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging. (2019a) J Vis Exp. 2019 Mar 19;(145). doi: 10.3791/59156. PubMed PMID: 30958469
Steyer AM, Schertel SA, Nardis C, Möbius W: FIB-SEM of mouse nervous tissue: Fast and slow sample preparation (2019b). Methods in Cell Biology, Volume 152, pp.1-21, ISSN 0091-679X, https://doi.org/10.1016/bs.mcb.2019.03.009