Technologien

Bei der "klassischen" Fluoreszenzmikroskopie erfolgen Beleuchtung und Detektion über dasselbe Objektiv. Hierbei wird das gesamte Sichtfeld beleuchtet und ein Teil davon auf einer Kamera (typischerweise sCMOS) abgebildet. Die unscharfe Emission ausgehend von ober- und unterhalb der Fokusebene wird bei dieser Methode nicht entfernt, so dass kein optischer Schnitt generiert wird. Dieser kann jedoch nachträglich durch rechnerische Entfaltung ermittelt werden. Insgesamt zeichnet sich die Weitfeldmikroskopie durch Schnelligkeit, Empfindlichkeit und einfache Bedienung aus, was sie zu einer optimalen Wahl für Live-Imaging und High-Content-Screening von relativ dünnen Proben (z. B. Säugetierzellen in Kultur, Bakterien, dünne Gewebeschnitte) macht.

Dank seiner Fähigkeit optische Schnitte zu generieren, ist das konfokale LSM eines der meist eingesetzten Systeme bei zell- und entwicklungsbiologischen Fragestellungen. Die Technologie ist durch ein hohes Maß and Flexibilität ausgezeichnet, welche erlaubt lebende und fixierte Präparate mehrfarbig und bei einer hohen lateralen und axialen Auflösung (bis zu ~ XY: 140 nm, Z: 800 nm) aufzunehmen. Üblicherweise, basiert die Technologie auf einem fokussierten Anregungslaserstrahl, der die Probe und die darin enthaltene Fluorophore abrastert, was zu emittierten Photonen führt, die von Punktdetektoren erfasst werden. Der optische Schnitt wird durch den Einsatz einer Lochblende generiert, welche das unscharfe, von ober- und unterhalb der Fokusebene stammende Licht, entfernt. Da die Probe Punkt für Punkt abgetastet wird, ist diese Technik eher langsam und kann bei besonders großen Proben einschränkend sein. Es gibt jedoch schnelle "Resonant"-Scanner, die deutlich schnellere konfokale Aufnahmen von fixierten oder lebenden Proben mit reduzierter Phototoxizität ermöglichen. Darüber hinaus kann ein konfokales Mikroskop verwendet werden, um Informationen über die Probe aus dem reflektierten Laserlicht zu gewinnen, wodurch die Anforderung der Markierung jeglicher Art umgangen werden kann. Reflektiertes Laserlicht bei einem konfokalen LSM kann auch eingesetzt werden um Interferenzreflexionssignale aufzuzeichnen, womit die Zelloberflächenadhäsion in festen oder lebenden Proben untersucht werden kann.

Die konfokale Spinning-Disk-Mikroskopie genießt die Vorteile der schnellen Weitfeldbeleuchtung und ist zugleich in der Lage optischen Schnitte zu generieren. Das Beleuchtungs- und Detektionslicht wird durch eine schnell rotierende, durch vielen Lochblenden besetzte, Scheibe geleitet, welche die einzelne Lochblende eines Konfokal LSMs auf vielfacher Weise parallelisiert. In Kombination mit sCMOS-Kameras ausgezeichnet durch ihrer hohen Quanteneffizienz ermöglicht diese Methode eine außergewöhnlich schnelle Abbildung von Proben und einer geringeren Phototoxizität bei Aufnahmen lebendiger Proben. Obwohl die Spinning-Disk-Mikroskopie weniger flexibel und vielseitig als ein konfokales LSM ist, ermöglicht die hohe Aufnahmegeschwindigkeit die Untersuchung sehr schneller Prozesse in lebenden Zellen oder die Aufnahme großer Volumina von fixierten Proben, z. B. ganzer Objektträger. Die Kombination mit anderen Techniken, wie z. B. der „Fluorescence Recovery After Photobleaching“ (FRAP), ist möglich.

Bei der TIRF-Mikroskopie wird die Probe unter einen flachen Winkel beleuchtet, so dass es zu einer totalen Reflektion kommt. Hierbei entsteht ein evaneszentes Feld hinein in die Probe, in welcher Fluorophore bis zu einer Tiefe von ~ 100 nm angeregt werden können. Diese Konstellation resultiert in sehr dünnen optischen Schnitten und einem sehr guten Signal-Rauschverhältnis, da fast keine Fluorophore außerhalb des evaneszenten Feldes angeregt werden. Eine Beleuchtung knapp unterhalb des kritischen Winkels führt zu einer hochgradig geneigten und laminierten optischen Schicht (HiLO), die eine dünne, geneigte Ebene innerhalb der Zellen anregt. Diese Schicht ist dicker ist als die TIRF, ermöglicht aber eine etwas tiefere Abbildung in der Probe. Die Detektion mit einer Kamera macht TIRF und HiLO zu einer sehr schnellen und empfindlichen Methode, die für die „selective plane illumination microscopy“ (SMLM) und für die Verfolgung einzelner Moleküle eingesetzt wird.

Bei der Multiphotonenmikroskopie handelt es sich um ein LSM, das einen gepulsten Hochleistungslaser im nahen Infrarotbereich verwendet. Die häufigste Applikation dieser Methode - die Zwei-Photonen-Mikroskopie - beruht auf der gleichzeitigen Absorption von zwei Photonen durch Fluoreszenzfarbstoffe. Die Wahrscheinlichkeit, dass dieses Ereignis eintritt, nimmt mit zunehmender Entfernung vom Brennpunkt rasch ab. Daher werden beim Einsatz dieser Technik bei der LSM die Fluoreszenzfarbstoffe in einem genau definierten optischen Schnitt angeregt und deren Emission darin aufgenommen. Darüber hinaus ist die Abbildung von biologischem Gewebe bis zu einer Tiefe von 1 mm möglich, da die Streuung durch das verwendete Infrarot-Anregungslicht reduziert wird. Daher ist das Zwei-Photonen-LSM die Methode der Wahl, wenn es um die Aufnahme optischer Schnitte von trüben, streuenden, dicken Proben geht, und wird häufig zur Aufnahme dicker Gewebeschnitte, Organoide, Sphäroide oder bei der intravitalen Bildgebung verwendet. Je nach Probe kann jedoch die Energie von zwei Anregungsphotonen kombiniert werden, um ein Photon mit der doppelten Energie in einem Prozess zu erzeugen, der als „second harmonic generation“ (SHG) bezeichnet wird. Kollagen kann mittels SHG markierungsfrei sichtbar gemacht werden. Ein weiterer Fall ist die Interaktion von drei Photonen innerhalb des Brennpunkts, die in der Mikroskopie der „third harmonic generation“ (THG) genutzt wird. Damit lässt sich Myelin markierungsfrei sichtbar machen.

Die Probe wird mit einem dünnen Lichtblatt beleuchtet, das in der Regel von einem oder mehreren zusätzlichen Beleuchtungsobjektiven mit niedriger NA erzeugt wird, die senkrecht zum Detektionsobjektiv angeordnet sind, welches das emittierte Licht auf eine Kamera projiziert. Im Gegensatz zu einem Konfokal LSM oder zu einem Spinning Disk LSM wird bei der SPIM-Geometrie nur der Bereich beleuchtet, in dem die Fluoreszenz nachgewiesen wird, was zu einer sehr geringen Phototoxizität und Ausbleichen führt. In Kombination mit optischem Clearing und einer sCMOS-Kamera ist SPIM die Technik der Wahl für die schnelle und schonende volumetrische Bildgebung von großen Proben oder ganzen Organen.

Infolge einer Anregung kann ein Fluorophor innerhalb einer bestimmten Zeitspanne ein Photon emittieren. Es handelt sich hierbei um die Fluoreszenzlebensdauer, welche bei typischen Fluorophoren wenige Nanosekunden beträgt. Bei FLIM (typischerweise mit einem LSM-Mikroskop aufgenommen) werden die Ankunftszeiten der Photonen nach wiederholten Anregungspulsen an jedem Pixel für das gesamte Sichtfeld aufgezeichnet. Die Lebensdauer kann für einige Fluorophore sehr spezifisch und konstant sein, während die Lebensdauer anderer mit Veränderungen in ihrer molekularen Umgebung korrelieren kann. Die Fluoreszenzlebensdauer kann verwendet werden, um das Signal von Fluorophoren zu trennen, die ansonsten voneinander spektral nicht zu unterscheiden sind, um quantitative FRET-Experimente (Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer) zur Untersuchung molekularer Interaktionen und Struktur durchzuführen und um Signale unabhängig von der Hintergrundstreuung und Autofluoreszenz zu erfassen. Es gibt eine ständig wachsende Anzahl von FRET/FLIM-Biosensoren, die zur Untersuchung von zellulären Signalnetzwerken eingesetzt werden können (z. B. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.8b00333).

Als Superauflösung werden alle Methoden bezeichnet, die eine Auflösung jenseits der Beugungsgrenze des Lichts gemäß dem Abbeschen Gesetz erreichen. Superauflösung kann durch Formung des Beleuchtungsmusters (z. B. STED), der zeitlichen Trennung einzelner emittierender Fluorophore (SMLM) und der Neuzuordnung der Pixelintensitäten auf der Grundlage des Beugungsmusters (z. B. AiryScan) erreicht werden.

Die Position eines einzelnen emittierenden Fluorophors kann mit einer Genauigkeit bestimmt werden, die weit über die Auflösungsgrenze hinausgeht. In einer typischen Probe emittieren jedoch fast alle Fluorophore gleichzeitig, so dass es unmöglich ist, die Position eines einzelnen Emitters zu bestimmen. SMLM macht sich die Tatsache zunutze, dass einige Fluorophore "blinken", d. h. stochastisch emittieren können (je nach dem als PALM, STORM, GSD oder PAINT bezeichneten Mechanismus). Dadurch werden die Emissionsereignisse zeitlich getrennt. Die Aufzeichnung vieler Blinkereignisse im Laufe der Zeit und die Bestimmung ihrer Position ermöglichen die Rekonstruktion eines hochaufgelösten Bildes. Diese Technik erfordert eine hervorragende Färbung, dünne Proben und mehrere Nachbearbeitungsschritte, die zu einer Auflösung von ~ 10-20 nm in der XY-Ebene führen.

MINFLUX (Minimal Photon Fluxes) ist eine Super-Resolution-Methode zur Lokalisierung von Fluorophoren mit nm-Genauigkeit in 3D (<3 nm in alle Richtungen). Dabei wird ein donutförmiger Anregungsstrahl verwendet, der iterativ so verschoben wird, dass sich der Fluorophor in der Mitte des Donuts befindet. Dies ist die minimale Anregung. MINFLUX kann auch zum Tracken einzelner Moleküle mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung (< 20 nm innerhalb von 100 Mikrosekunden) eingesetzt werden.

STED ist eine LSM-Superauflösungsmethode, bei der ein zweiter, so genannter Depletion-Strahl verwendet wird, der den Anregungsstrahl konzentrisch in Form eines Doughnuts umgibt. Der Depletion-Strahl "schaltet" Fluorophore aus und reduziert den Bereich der Emission auf das Zentrum des Anregungsstrahls. Auf diese Weise liefert STED ein superaufgelöstes Bild mit einer typischen Auflösung von > 50 nm in XY- und > 80 nm in z-Richtung (letzteres erfordert 3D STED). Im Vergleich zu SMLM ist STED schnell und relativ einfach zu handhaben und sowohl mit lebenden als auch mit relativ dicken Proben kompatibel.

Das Massenphotometer ist ein Instrument, das erst seit kurzem auf dem Markt erhältlich ist. Es nutzt die Interferenzreflexionsmikroskopie und die interferometrische Streumikroskopie, um die Streuung einzelner Moleküle zu messen. Das Streusignal ist direkt proportional zur Molekülmasse, so dass mit dieser Technik die Masse von Einzelmolekülen und makromolekularen Komplexen in Lösung, in ihrem nativen Zustand und ohne jegliche Markierung gemessen werden kann. Die Technik ist einfach zu handhaben, schnell und erfordert nur eine minimale Menge an Material (ca. 20 μl bei 5-10 nM).

In einem Durchflusszytometer werden die Zellen von einem Flüssigkeitsstrom (Hüllflüssigkeit) getragen und passieren in einer einzigen Reihe den/die Anregungslaserstrahl(en). Dadurch ist das System in der Lage, die Fluoreszenzintensität und die Streuungseigenschaften von Tausenden von Zellen sehr schnell zu messen. Im Zellsortierer werden die detektierten Signale zur Trennung der Populationen verwendet. Der Zellsorter erzeugt Flüssigkeitströpfchen mit einzelnen Zellen, die elektrisch aufgeladen und entsprechend den gemessenen Fluoreszenz- oder Streuparametern in einen bestimmten Behälter gelenkt werden. Ein Durchflusszytometer wird zur Charakterisierung von Zellpopulationen, zur Anreicherung von Populationen eines bestimmten Typs und zur Gewinnung einzelner Zellklone, z. B. für die Erzeugung transgener endogener Zelllinien, eingesetzt.

Ein Plattenlesegerät kann als ein Ein-Pixel-Mikroskop betrachtet werden, bei dem eine Messung pro Vertiefung einer Multi-Well-Platte durchgeführt wird. Es ist ideal, um eine Platte schnell zu untersuchen und Absorption, Fluoreszenz, Fluoreszenzanisotropie und andere Parameter zu messen.